國家衛生和計劃生育委員會辦公廳

關于印發《醫院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序》等技術規范的通知

　　
衛辦醫政函〔2013〕402號



各省、自治區、直轄市衛生廳局（衛生計生委），新疆生產建設兵團衛生局：

　　根據人感染H7N9禽流感疫情聯防聯控工作機制會議議定事項及《關于醫院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關工作的通知》（衛辦醫政函〔2013〕383號，以下簡稱《通知》）精神，為指導醫院做好人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作，我委組織制定了《醫院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序》（附件1），并委托中國疾控中心制定了《人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全保障基本要求》（附件2）等技術規范。現轉發給你們（可從國家衛生和計劃生育委員會網站醫政管理欄目中下載），供醫院在開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測時參考使用。

　　各省級衛生（衛生計生）行政部門要按照《通知》有關要求，組建省級疾控機構實驗室和省級臨床檢驗專家共同組成的專家組，對醫院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作提供技術指導和支持，負責醫院實驗室核酸檢測質量控制工作。要組織本轄區人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測定點醫院檢驗人員進行培訓，認真學習掌握相關要求，提高檢驗人員技術能力和水平。醫院開展病毒核酸檢測時，應當按照技術規范有關要求，規范開展檢測工作，重視實驗室質量控制，保障實驗室生物安全，做好檢驗人員職業防護，保證檢測結果科學、可靠。



附件：1.醫院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序.docx

2.H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書.docx



國家衛生和計劃生育委員會辦公廳

2013年5月16日





醫院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序


　　　　 
　　　　一、目的
　　　　確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過程標準化、規范化，降低人為不規范操作對檢測結果造成的影響，保證結果的準確性和可重復性。
　　　　二、適用范圍
　　　　醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室按照《關于醫院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關工作的通知》（衛辦醫政函〔2013〕383號）和《關于做好醫療機構人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知》（衛發明電〔2013〕29號）有關要求，使用國家疾病預防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。
　　　　三、樣本采集、運送和保存
　　　　盡量采集病例發病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)。可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率。患者有下呼吸道樣本時，應優先采集。
　　　　根據試劑說明書對樣本采集方法有關要求，制訂樣本采集標準操作程序（SOP），并組織樣本采集人員進行培訓及考核。樣本的采集應當嚴格按照SOP進行。
　　　　樣本采集后，按照《人間傳染病的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒的相關規定進行包裝，用密封容器立即送往實驗室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達實驗室后，應盡快進行檢測，24小時內能檢測的樣本可置于2～8℃暫時保存，24小時內無法檢測的樣本則應置于≤-70℃狀態保存。如無-70℃保存條件時，可于-20℃冰箱暫存。樣本避免反復凍融。
　　　　樣本采集、處理、運輸及保存不當時，可因病毒RNA降解出現假陰性結果，也可因為樣本“污染”出現假陽性結果。
　　　　四、PCR檢測
　　　　（一）樣本處理
　　　　樣本的核酸提取應當在樣本處理區進行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進行核酸提取。樣本應盡可能新鮮，提取過程應嚴防RNA酶污染及操作不當導致的RNA降解。提取過程如涉及離心步驟，應采用低溫冷凍離心機；在生物安全柜內進行加樣、提取過程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤內平鋪的碎冰上。提取好的RNA應及時用于檢測，否則應當-70℃保存。如無-70℃保存條件，可于-20℃冰箱暫存。
　　　　（二）試劑準備
　　　　試劑準備應當在試劑準備區進行。根據所用的試劑盒，樣本可進行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應當在室溫充分復融，混勻并瞬時低速離心。反應液分裝時盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免管內溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應液的反應管應當扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本處理區。
　　　　（三）加樣
　　　　加樣應當在樣本處理區進行。加樣時應當使樣品完全落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
　　　　按試劑、儀器說明書完成加樣和PCR反應管準備。
　　　　（四）PCR擴增檢測
　　　　PCR擴增檢測在擴增區進行。待檢PCR管轉移至擴增區，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設定循環參數。
　　　　（五）結果分析
　　　　根據所用試劑盒說明書設置基線值（baseline）。熒光閾值（threshold）設定以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線（無規則的噪音線）的最高點為原則，且Ct值應大于所設置的擴增循環數（或顯示為undet）。使用儀器配套軟件自動分析結果。
　　　　（六）質量控制
　　　　檢測過程對可能出現的假陽性和假陰性進行質量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時，至少應當有1份弱陽性和3份陰性質控樣本（多份陰性質控樣本設置對實驗室“污染”所致假陽性的監控更為有效），隨機放在所檢測標本的中間。弱陽性質控樣本可為檢測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內標”控制假陰性，或弱陽性質控樣本來源困難，可暫不設弱陽性質控。陰性質控樣本采用標本采集管內溶液即可。質控樣本應與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過程。
　　　　試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實驗室的有效性，按試劑盒說明書進行。
　　　　（七）實驗結果的判定與解釋。
　　　　按照試劑盒說明書進行。對于出現弱陽性結果的樣本應進行重復檢測，并注意與可能的實驗室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽性結果區別。
　　　　五、檢測結果報告
　　　　按照試劑盒說明書進行。
　　　　六、其它注意事項
　　　　（一）人感染H7N9禽流感病毒實驗室活動、樣本采集和運輸按照《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒進行管理。從事人感染禽流感檢測的技術人員必須經過生物安全培訓并具備相應的實驗技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護措施（使用眼罩、N95型口罩等）。樣本核酸提取必須在Ⅱ級生物安全實驗室，經過年檢合格的二級生物安全柜內進行。實驗室應具有良好的通風。
　　　　（二）注意儀器設備的日常和定期維護，加樣器、擴增儀和溫育設備應進行定期校準。試劑盒及一次性使用的無DNA酶和RNA酶PCR反應管、離心管、帶濾芯吸頭等應進行每批質檢。
　　　　（三）實驗應嚴格分區操作；各區物品、工作服等均應當專區專用，不得交叉使用。實驗后應及時清潔工作臺，以防污染。
　　　　（四）每批實驗室后，可采取實驗室通風、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產物氣溶膠污染。
　　　　（五）使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應試劑盒說明書（見附件1、2）有關要求。
　　　　 
附件：1.H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）說明書
2.H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）說明書
 
　　　　【產品名稱】
　　　　通用名稱：H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）
　　　　英文名稱：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA（Fluorescence PCR）
　　　　【包裝規格】48人份/盒。
　　　　【預期用途】
　　　　本試劑用于對咽拭子樣本中H7N9亞型禽流感病毒RNA進行定性檢測，用于H7N9禽流感病毒感染的輔助診斷及流行病學監控。
　　　　【檢驗原理】根據熒光PCR技術原理，針對H7N9亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因設計特異性引物和Taqman探針，通過熒光PCR檢測儀進行檢測，從而實現對H7N9亞型禽流感病毒RNA的定性檢測。試劑盒以正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA為正常人體細胞對照，對提取和檢測過程進行監控。
　　　　【主要組成成分】
　　　　 
　　　 
名稱 成分 　　規格 數量(管)
H7反應液 　　含內標RNP 、H7亞型特異基因的引物探針混合液 1.0ml/管 1
N9反應液 　　含內標RNP 、N9亞型特異基因的引物探針混合液 1.0ml/管 1
DNA聚合酶 　　DNA聚合酶，不可用其他同類DNA聚合酶替代 60μl /管 1
逆轉錄酶 　　逆轉錄酶，不可用其他同類逆轉錄酶替代 60μl /管 1
陽性對照 　　RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物 1.0ml/管 1
陰性對照 　　DEPC水 1.0ml/管 1
　　本品各組成成分均不得與其他產品或不同批號產品中的相應組成成分進行互換。
　　 
　　　　本品不包含，但對試驗必須的設備和試劑：
　　　　生物安全柜、臺式離心機、旋渦震蕩器、拭子、采樣管、無菌病毒采樣液、1.5 ml無核酸酶的離心管、全自動熒光PCR檢測儀專用PCR擴增管和核酸分離試劑盒(硅膠膜吸附法，北京金豪制藥股份有限公司，Cat：BJH101)。
　　　　【儲存條件及有效期】-20℃冷凍保存，有效期2個月，陽性對照反復凍融次數不得超過5次。
　　　　【適用儀器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光PCR檢測儀。
　　　　【樣本要求】
　　　　1. 樣本類型：咽拭子。推薦使用金豪公司生產的微生物采樣及運送管（12人份/盒）。
　　　　2. 拭子、采樣管和保存液：
　　　　2.1拭子選擇：應使用頭部為合成纖維（例如，聚酯纖維），桿部為鋁或塑料的拭子。
　　　　2.2采樣管：外螺旋口、耐-70℃凍存，可容納3 ml病毒采樣液。
　　　　2.3無菌病毒采樣液：應含有蛋白質穩定劑，阻止細菌和真菌生產的抗生素，緩沖液，經無菌處理。
　　　　3.樣本采集、運輸和保存：
　　　　由于H7N9亞型禽流感病毒為呼吸道傳播病毒，有關生物安全應按照“《人間傳染的病原微生物名錄》”中高致病性禽流感病毒進行管理。
　　　　3.1采集：采集病人發病3日內的咽拭子標本，用于病原檢測。用微生物采樣及運送管內的采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3ml保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存并在48小時內送達實驗室。
　　　　3.2保存和運輸：新鮮采集樣本應在4℃條件下48小時運送到檢測實驗室。保存樣本可在-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70℃冰箱。冷凍樣本應在冷凍條件下送至實驗室。運輸時在包裝箱內填充吸水材料，運輸過程中保持標本采集管直立狀態，不能傾斜。
　　　　樣本送至實驗室后，立即進行處理和分裝，避免反復凍融。臨床樣本保存在4℃不能超過4天。
　　　　4.咽拭子標本的處理
　　　　咽拭子要在標本保存液中充分攪動（至少 40 下），以洗脫拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種細胞或直接提取RNA。如果發現有細菌污染，須用濾器過濾除菌。
　　　　【檢驗方法】
　　　　1. 核酸提取：
　　　　取200μl咽拭子樣本進行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 (硅膠膜吸附法)，該試劑盒可用于對呼吸道懸浮液樣本中的病毒RNA提取，并按試劑盒說明書要求操作。
　　　　本品的陽性對照和陰性對照均參與核酸提取。
　　　　1.1. 準備及注意事項：
　　　　1.1.1 分別在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml無水乙醇，顛倒充分混勻，并在瓶身上加以標識。
　　　　1.1.2  吸取所需的洗脫液，加至一無核酸酶的eppendorf管中，于70℃預熱。
　　　　1.1.3  冷凍樣本應室溫融化，輕微震蕩混勻后使用。
　　　　1.1.4  區分操作中的離心設置（rpm和g），本產品操作過程均為室溫離心。
　　　　1.1.5  助沉劑在低溫保存時可能呈膠狀，吹打混勻即可使用。
　　　　1.2. 樣本裂解及核酸吸附
　　　　1.2.1  在1.5ml無核酸酶的離心管中加入10μl助沉劑和400μl裂解液，加入200μl待處理樣本，劇烈震蕩2分鐘，室溫靜置10分鐘。
　　　　注：如樣本體積小于或大于200μl，需按比例改變助沉劑、裂解液以及無水乙醇體積。體積大于400μl樣本應分多次進行處理。
　　　　1.2.2  加入480μl無水乙醇，顛倒混勻，吸取600μl裂解混合物轉移到核酸吸附柱中。
　　　　注：如樣本體積小于或大于200μl，需按比例改變乙醇用量。
　　　　1.2.3  3500g離心2分鐘，取下套管，倒掉套管中的液體。將剩余裂解混合物轉移至核酸吸附柱，重新離心一次，棄套管中的液體。
　　　　1.2.4  將核酸吸附柱重新裝入套管，6000g離心1分鐘，倒掉套管中的液體。
　　　　1.3. 核酸純化
　　　　1.3.1  將核酸吸附柱重新裝入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g離心1分鐘，將核酸吸附柱裝入一個干凈套管中。
　　　　1.3.2  在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，靜置1分鐘，6000g離心1分鐘。
　　　　1.3.3  倒掉套管中的液體，將核酸吸附柱重新裝入套管。
　　　　1.3.4  重復一次1.3.2步驟(本步驟不用靜置1分鐘)。
　　　　1.3.5  將核酸吸附柱換一新套管，13000rpm離心3分鐘。
　　　　1.4. 核酸洗脫
　　　　1.4.1  將核酸吸附柱裝入一無核酸酶1.5ml離心管，小心在吸附膜中央加入50μl預熱洗脫液，室溫靜置4分鐘。
　　　　1.4.2  10000 rpm離心2分鐘，離心管中液體即待測樣本RNA。
　　　　2. PCR擴增：
　　　　2.1 實驗設計：
　　　　2.1.1待檢樣本檢測：每份樣本分別使用2種反應液（H7和N9反應液）進行檢測，綜合2種反應液的檢測結果對樣本進行判定。
　　　　2.1.2對照品檢測：每次試驗都應設置陰性對照和陽性對照。
　　　　2.2反應體系的配制：
　　　　2.2.1準備工作：將2種反應液（H7和N9反應液）融化后振蕩混勻，離心6000rpm 10秒。
　　　　2.2.2 2種反應體系（H7和N9）的配制：取2個1.5ml 無核酸酶離心管，計算待測樣本數量(n)，分別取20μl×（n+2）反應液（H7和N9）、0.5μl×（n+2）DNA聚合酶和0.5μl×（n+2）逆轉錄酶充分混勻，離心6000rpm 10秒。
　　　　n + 2 = n份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照；
　　　　2.3反應體系分管：
　　　　每份待測樣本設置2個PCR擴增管（H7和N9），分別將每種反應體系按20μl/管分裝至對應的PCR擴增管中。
　　　　2.4加樣：
　　　　每份待測樣本RNA、陽性對照、陰性對照以5μl/管分別加入2個PCR擴增管中。
　　　　2.5擴增檢測：
　　　　將加樣后的PCR擴增管分別轉移到全自動熒光定量PCR檢測儀上進行擴增檢測，不同儀器的設置如下：
　　　　2.5.1全自動熒光定量PCR檢測儀（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）擴增程序：
　　　　對于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光定量PCR檢測儀，熒光信號設置為：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型號儀器可設置為FAM和HEX通道。熒光PCR擴增程序的設置見表1。反應總體積為25μl。
表1.熒光PCR擴增程序
　　步驟 　反應溫度 　　時間 是否采集光 循環數
　　逆轉錄及變性 　50℃ 　30分鐘 　　否 　　1
　95℃ 　3分鐘 　　否
　　預擴增 　95℃ 　15秒 　　否 　　5
　50℃ 　30秒 　　否
　72℃ 　1分鐘 　　否
　擴增及熒光收集 　95℃ 　10秒 　　否 　　40
　55℃ 　40秒 　　是
　　　　2.5.2 全自動熒光定量PCR儀（Roche LightCycler系列）擴增程序：
　　　　選擇FAM、HEX通道收集熒光。熒光PCR擴增程序見表2。
表2.熒光PCR擴增程序
　　步驟 反應溫度 　　時間 是否采集熒光 循環數
逆轉錄及變性 50℃ 　　30分鐘 　　否 　　1
93℃ 　　3分鐘 　　否
　　預擴增 93℃ 　　15秒 　　否 　　5
50℃ 　　30秒 　　否
72℃ 　　1分鐘 　　否
擴增及熒光收集 93℃ 　　10秒 　　否 　　40
55℃ 　　40秒 　　是
　　 
　　　　3. 結果分析：
　　　　3.1本品H7熒光探針的報告熒光為FAM，N9熒光探針的報告熒光為FAM，RNP熒光探針的報告熒光為HEX。所以應選擇FAM通道和HEX通道分析試驗結果。
　　　　3.2 基線（Baseline）范圍根據儀器要求設定，目的為校正背景熒光干擾，終止循環（End）一般設置為最強樣本出現擴增信號的前3-4個循環。
　　　　3.3 閾值線用于判斷樣本是否擴增，應調整使閾值線高于熒光背景和陰性對照的熒光信號，或點擊分析（Analysis）自動獲得。
　　　　4. 質量控制：
　　　　每次試驗應設置陽性對照和陰性對照，且應符合以下要求，否則試驗結果不成立。
　　　　4.1陰性對照無Ct值或Ct值為0。
　　　　4.2 陽性對照Ct值小于30.0。
　　　　【參考值（參考范圍）】
　　　　Ct值≤37.0報告該反應陽性；
　　　　無Ct值或Ct值為0報告該反應陰性；
　　　　37.0＜Ct值＜40.0為灰區；
　　　　內標RNP有效的范圍為：0＜Ct值＜33.0；
　　　　【檢驗結果的解釋】
　　　　1. 在內標RNP結果成立的條件下各種判讀模式如下：
反應液 模式1 模式2 模式3 模式4
H7 - - + +
N9 - + - +
RNP + + + +
結果判斷 H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 H7N9亞型禽流感病毒RNA陽性
　　注：在內標RNP結果不成立的條件下視為檢測異常，應重新采樣檢測。
　　　　2. 結果在灰區的樣本需重復試驗：取200μl樣本重新提取RNA（核酸分離試劑盒中裂解液、無水乙醇的用量加倍，其他組分的用量不變）并檢測。復檢結果Ct＜40.0的樣本為陽性，否則為陰性。
　　　　3. 內標RNP檢測靶物質為正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA，用于對樣本中RNA的提取和擴增檢測過程進行有效監控。
　　　　如果該份樣本的RNP檢測 Ct值≥33.0，可能為以下原因：
　　　　3.1 未采集到足夠的正常人上皮細胞，應重新采樣。
　　　　3.2核酸提取過程異常，導致RNA損失，應重新提取。
　　　　3.3樣本中存在RT-PCR抑制物質，可稀釋后檢測；
　　　　【檢驗方法的局限性】
　　　　1.樣本中RNA濃度低于本產品的最低檢出值（100copies/ml）時可能出現假陰性。
　　　　2.目前研究顯示，發病后兩日內取樣檢測，病毒RNA檢出率最高，隨發病時間的延長，病毒被清除，病毒核酸的檢出水平迅速下降。因此應在發病后盡早采樣，必要時可采用多部位取樣檢測。臨床評價應結合其他臨床癥狀和實驗室檢測指標進行判斷。
　　　　【產品性能指標】
　　　　1.本品可最低檢出100copies/ml稀釋物。
　　　　2.本品對季節性流感（H1N1以及H3N2）滅活病毒、B型流感滅活病毒、高致病性禽流感滅活病毒（H5N1）RNA進行檢測，結果為陰性。
　　　　【注意事項】
　　　　1.開始檢測前請仔細閱讀本說明書全文，并嚴格按照要求進行操作。
　　　　2.實驗室配置和試驗操作請按照《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》進行；整個檢測過程應嚴格分區進行：PCR反應體系的配置區；標本處理、加樣區；各區使用的儀器、設備、耗材和工作服應獨立專用。
　　　　3.H7N9亞型禽流感為經呼吸道傳播疾病，應按照相關要求進行。樣本的采集、處理、運輸和保存均存在一定生物危害。樣本的采集、運輸和保存應按照乙類傳染病進行管理；標本的提取必須在生物安全二級實驗室的負壓生物安全柜中完成；試驗中接觸過標準品和對照品的廢棄物品（如吸頭）、擴增完畢的離心管、標本等應進行無害化處理后方可丟棄。
　　　　4.不同批號的試劑請勿混用，請在有效期內使用試劑盒。
　　　　5. 本產品僅用于體外診斷檢測。
　　　　【參考文獻】
　　　　1. 微生物和生物醫學實驗室生物安全通用準則（WS 233-2002）
　　　　2.《人感染H7N9禽流感診療方案（2013年第2版）》
　　　　3.《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛醫發[2002]10號）
　　　　【生產企業】
　　　　企業名稱：北京金豪制藥股份有限公司
　　　　生產地址：北京市北京經濟技術開發區運成街7號
　　　　注冊地址：北京市北京經濟技術開發區運成街7號1號樓
　　　　郵政編碼：100176
　　　　電話號碼：010-67878866
　　　　傳真號碼：010-67881632
　　　　網    址：www.kinghawk828.com
　　　　【醫療器械生產企業許可證編號】京藥監械生產許20050017號
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　

H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒
（PCR-熒光探針法）說明書
　　　　 
　　　　【產品名稱】通用名稱：H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
　　　　英文名稱：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)  
　　　　【包裝規格】大包裝，48反應/盒
　　　　【預期用途】
　　　　流感病毒可分為甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依據流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分為1-16種亞型，根據病毒神經氨酸酶蛋白（NA）的不同可分為1-9種亞型，HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。而禽類特別是水禽是所有這些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一種。H7N9流感病毒既可以感染禽類，也可以感染人。人感染H7N9禽流感會出現嚴重肺炎，癥狀包括發燒、咳嗽、呼吸困難等。
　　　　本試劑盒適用于檢測呼吸道樣本、血清、肺組織等樣本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于該病毒感染的實驗室診斷和宿主動物的監控。檢測結果僅供研究，不用于臨床診斷。
　　　　【檢驗原理】
　　　　本試劑盒基于實時熒光PCR技術，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區作為擴增靶區域，設計特異性引物探針，通過一步法實時熒光PCR體系擴增對H7N9禽流感病毒進行定性檢測。反應體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對應的PCR反應Buffer、逆轉錄酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸單體（dNTPs）、Mg2+等成分，可實現對H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測。
　　　　【主要組成成分】
組分名稱 規格 數量
PCR檢測試劑 AIV H7 PCR反應液A 816µl/管 1
AIV N9 PCR反應液A 816µl/管 1
AIV H7N9 PCR反應液B 288µl/管 1
AIV H7N9內標溶液 240µl/管 1
質控品 陰性質控品  200µl/管 1
AIV H7N9陽性質控品 200µl/管 1
 
　　　　【儲存條件及有效期】保存于-20±5℃，反復凍融次數＜5次，有效期9個月。
　　　　【適用儀器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀。
　　　　【樣本要求】
　　　　1 適用樣本類型：呼吸道樣本、血清、肺組織。
　　　　2 樣品采集、保存與運送。
　　　　標本采集、保存、運送請遵循《人感染H7N9禽流感病毒標本采集及實驗室檢測策略》。
　　　　【檢驗方法】
　　　　1.核酸提取
　　　　建議取200µl液態樣本進行核酸提取；組織樣本可以研磨液進行提取操作。可采用中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸提取試劑盒，請按照試劑盒說明書進行操作；也可選擇其他合適的商業化產品。本試劑盒中的內標溶液參與提取過程，若提取試劑盒中未說明內標的使用方法可在每200µl樣本中加入4µl內標溶液后進行核酸提取。
　　　　本試劑盒中的陰性質控品參與提取，用于對環境進行監控；AIV H7N9陽性質控品不參與提取，用于PCR檢測試劑的質控。
　　　　2.PCR擴增（ABI 7500儀器操作為例，ABI 7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊）
　　　　2.1分別配制AIV H7 RT-PCR反應體系和AIV N9 RT-PCR反應體系
　　　　2.1.1 AIV H7 RT-PCR反應體系配制
　　　　取適量PCR反應管（按AIV H7反應體系計算）；每管加入AIV H7 PCR反應液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應液B 3µl（也可按照單個反應的用量，計算PCR反應液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個PCR反應管中）。
　　　　2.1.2 AIV N9 RT-PCR反應體系配制
　　　　取適量PCR反應管（按AIV N9反應體系計算）；每管加入AIV N9 PCR反應液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應液B 3µl（也可按照單個反應的用量，計算PCR反應液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個PCR反應管中）。
　　　　2.2 于上述PCR反應管中分別加入處理后的陰性質控品、AIV H7N9陽性質控品、待測標本核酸各5µl，8,000rpm離心數秒，放入PCR擴增儀。
　　　　2.3探針檢測模式設置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反應條件設置為：50℃ 15min，1個循環；95℃ 15分鐘，1個循環；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集熒光），45個循環。保存文件，運行。
　　　　3.結果分析
　　　　3.1 反應結束后保存檢測數據文件。
　　　　3.2 分析條件設置：根據分析后圖像調節Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用戶可根據實際情況自行調整，Start值可以在3～15、End值可設在5～20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面察看結果。
　　　　【質量控制】
　　　　陰性質控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數增長期，VIC檢測通路擴增曲線為明顯對數增長期；
　　　　陽性質控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數增長期，且FAM檢測通道擴增曲線 Ct值≤32；
　　　　以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
　　　　【結果判定】
　　　　1.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值＞40，且在VIC檢測通道均有對數增長期，可判樣品為H7N9禽流感病毒陰性；
　　　　2.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應體系擴增曲線在FAM,VIC檢測通道均有對數增長期且FAM檢測通道Ct值≤40；可判樣品為H7N9禽流感病毒陽性；
　　　　3.如果檢測樣品的AIV H7或N9 RT-PCR反應體系僅其中之一的擴增曲線滿足判為陽性的要求，則需重復檢測；若重復檢測結果為H7及N9均陽性，則判H7N9禽流感病毒陽性；若重復檢測結果仍為H7（或N9）陽性，則只能判禽流感病毒H7（或N9）亞型陽性，并建議以其他方法做進一步確認。
　　　　【檢測方法的局限性】
　　　　1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送及保存質量有關。
　　　　2.樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現假陽性結果。
　　　　3.病毒在流行過程中的基因突變則也可能導致假陰性結果。
　　　　4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取試劑進行樣本處理時核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產的核酸提取試劑盒（離心柱法），用戶可根據具體要求進行選擇確認。
　　　　5.本檢測結果僅供臨床參考，如需確診病例請結合臨床癥狀及其他檢測手段.
　　　　【產品性能指標】
　　　　根據產品分析性能評估結果，本試劑盒的分析靈敏度為1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等）無交叉反應。
　　　　【注意事項】
　　　　1.實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規范，實驗人員必須進行專業培訓，實驗過程嚴格分區進行（試劑準備區、標本制備區、擴增和產物分析區），所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不能交叉使用；
　　　　2.為試劑和標本準備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；
　　　　3.試劑使用前要完全解凍，8,000rpm離心數秒后使用；
　　　　4.標本制備區所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；
　　　　5.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺和移液器；
　　　　6.本試劑盒內陽性質控品應視為具有傳染性物質，操作和處理均需符合相關法規要求：衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》。
　　　　【生產企業】企業名稱：中山大學達安基因股份有限公司
　　　　生產地址：廣州市高新技術產業開發區香山路19號；廣州市高新技術產業開發區荔枝山路6號
　　　　郵   編：510665          
　　　　電   話：020-32290789、8008304008
　　　　傳   真：020-32068820   
　　　　網   址：http://www.daangene.com
　　　　【醫療器械生產企業許可證編號】粵食藥監械生產許20040999號
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
附件2

人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全保障基本要求
 


　　　　為加強人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測規范化管理，做好實驗室生物安全管理工作，根據《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務院第424號令，以下簡稱《管理條例》）、《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》（衛生部45號令，以下簡稱《管理規定》）等有關要求，制定本標準。供醫院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測時參考使用。
　　　　一、樣本采集
　　　　（一）進行人感染H7N9禽流感病毒相關樣本（以下簡稱“樣本”）采集的操作人員必須經過生物安全培訓合格，并具備相應的操作技能。
　　　　（二）樣本采集過程中，操作人員要加強防護，應當穿戴防護服、眼罩、N95及以上水平的醫用防護口罩、雙層醫用乳膠手套、帽子等個體防護裝備。
　　　　（三）用于樣本采集的主容器必須采用優質塑料材質，且大小適合、帶螺旋蓋、內有墊圈、無菌、耐冷凍的密閉容器。樣本采集后，主容器蓋必須蓋嚴、擰緊，表面應當擦拭消毒。
　　　　（四）對診療過程中采集的各種臨床樣本，醫療機構應當加強生物安全管理，在進行動態風險溝通與評估基礎上，采取樣本登記造冊、專庫存放、專人負責以及必要的消毒處理等較嚴格的安全及安保管理措施。
　　　　（五）樣本采集過程中產生的醫療廢物要分類收集，應當在產生地點進行壓力蒸汽滅菌或可靠的化學消毒，然后按感染性、損傷性等醫療廢物收集處置。
　　　　二、樣本包裝和運輸
　　　　（一）負責樣本包裝和運輸的人員應當經過感染性物質包裝、運輸相關的生物安全培訓，并取得相應資格。
　　　　（二）運輸樣本必須采取三層包裝系統，由內到外分別為主容器、輔助容器和外包裝。
　　　　病毒培養物按照A類感染性物質進行包裝運輸，其他感染性物質按照B類感染性物質進行包裝運輸。
　　　　容器或包裝材料應當達到國際民航組織《危險物品航空安全運輸技術細則》相應包裝標準，符合防水、防破損、防外泄、耐高溫、耐高壓的要求。
　　　　（三）樣本包裝過程中，操作人員要根據所處環境條件參照本標準第一條第二款的相關要求采取加強防護。
　　　　（四）操作人員應當規范包裝檢測樣本：
　　　　1.應當在實驗室核心操作區內對裝有樣本的主容器外表面進行仔細檢查并擦拭消毒，確保無泄漏、表面無殘留物，并在外表面標明樣本編號、種類、姓名及采樣日期等信息。用足夠的吸收材料包裹主容器，然后放入輔助容器，擰緊（A類）或封嚴（B類）輔助容器，必要時消毒輔助容器外表面。若多個主容器裝入同一個輔助容器時，必須分別包裹，防止彼此接觸，并在多個主容器外面襯以足夠的吸收材料。
　　　　2.應在實驗室清潔區采用適當的襯墊材料將輔助容器固定在貼有統一標識的外包裝箱內，冰排或制冷器件應放在輔助容器和外包裝之間。樣本送檢單、樣本接收證明、準運證書、運送人員資質證明、發送和接收人員信息等相關文件材料應當放入防水的塑料袋中，置于外包裝箱內上方。
　　　　（五）樣本運輸前應當聯系接收機構實驗室，告知樣本送檢目的、樣本種類、數量和預計送達的時間等。
　　　　（六）負責運輸樣本的醫療衛生機構，應當按照《管理規定》有關要求，向省級衛生行政主管部門或中國疾病預防控制中心申請辦理《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本準運證書》。在每次運輸結束后，運輸單位須將運輸情況向省級衛生行政主管部門或中國疾病預防控制中心書面報告。
　　　　（七）包裝合格的樣本（三層包裝系統）可通過航空或陸路運輸。陸路運輸應專車運輸，并由2名或以上經培訓合格的人員護送。運輸途中樣本主容器應始終保持直立，運輸車輛內應攜帶具備清單及有效物品的應急處置箱（包），其中包括個體防護裝備、感染性材料溢灑處置器具、皮膚及創口處置器具、醫療廢物收集器具以及“生物危險”、“禁止通過”等警示標識。有關單位或者個人不得通過公共電（汽）車和城市鐵路運輸相關樣本。
　　　　三、樣本接收和包裝開啟
　　　　（一）負責樣本接收與包裝開啟的操作人員應具備相應的操作技能，通過生物安全培訓并取得相應資質。
　　　　（二）樣本包裝的開啟應在生物安全二級及以上級別的實驗室進行。樣本送檢單、準運證書、人員上崗證等相關文件材料的核查、登記，以及相關風險溝通/評估和開具樣本接收證明等工作應在實驗室清潔區內進行。
　　　　（三）包裝開啟過程中，操作者要根據所處環境條件參照本標準第一條第二款相關要求適時加強防護。
　　　　（四）實驗室操作人員應規范接收檢測樣本、開啟包裝：
　　　　1.操作人員應當在生物安全柜內開啟三層包裝系統的第二層輔助容器，并仔細檢查主容器表面有否破損、泄漏或殘留物，發現異常情況應當立即執行實驗室應急處置程序，同時登記并報告實驗室負責人。
　　　　2.操作者應當在生物安全柜內消毒主容器表面，核對樣本信息，進行下一步的實驗室檢測活動，或轉移至指定的保存/保藏地點及位置。
　　　　（五）包裝開啟和樣本核查結束后，應當在實驗室清潔區完成交接手續，開具樣本接收證明，交還外包裝和輔助容器等。實驗室操作人員應對所有異常情況進行詳細記錄，運輸和接受樣本的雙方人員簽字確認。
　　　　四、樣本分裝和檢測
　　　　（一）負責樣本分裝、檢測的操作人員應當具備人感染H7N9禽流感病毒相應的實驗操作能力，經過生物安全培訓，并取得培訓合格資質。
　　　　（二）實驗室用于人感染H7N9禽流感病毒檢測的設備、設施必須運行良好，生物安全柜和壓力蒸汽滅菌器應當年檢合格。
　　　　（三）在生物安全二級實驗室從事相關實驗活動時，操作人員應當配戴眼罩、N95及以上水平的醫學防護口罩，穿戴防護服、雙層乳膠手套等個體防護裝備。
　　　　（四）實驗室生物安全等級要求：
　　　　1.疑似病例未經培養的臨床樣本應當在生物安全二級實驗室的生物安全柜內分裝、滅活和核酸提取。
　　　　2.人感染H7N9禽流感病毒的分離培養應當在生物安全三級實驗室進行。
　　　　3.動物感染實驗應當在動物生物安全三級實驗室進行。
　　　　（五）開展人感染H7N9禽流感病毒相關實驗活動時，應當有２名以上的操作人員共同進行。
　　　　（六）實驗過程中產生的醫療廢物要分類收集，應在產生地點進行消毒滅菌，然后按醫療廢物收集處置。
　　　　五、樣本保存和銷毀
　　　　（一）各醫療機構應當將陽性樣本按照要求集中專庫保存。
　　　　（二）陽性樣本、分離物的保存及銷毀應當按照《管理條例》等法規和規范性文件有關要求執行。